دانلود ترجمه مقاله پروتئومیکس پروتئاز غشایی: شناسایی MS سوبسترای متالوپروتئیناز MT- 1 تعریف نشده

1. مقدمه 2. فرایندهای تجربی 3. نتایج 4. بحث و بررسی

با اصلاح پروتئولیتیک پروتئین های سیگنالینگ کم و گیرنده های غشایی ، پروتئازها عمل کنترل پس از ترجمه قوی را بر رفتار سلولی پس ترشح انجام می دهند. از این رو ، کشف سوبسترا برای درک نقش بیولوژیکی پروتئازها در in vivo ضروری است. در واقع ، متالوپروتئینازهای ماتریکس (MMPs )، در طولانی مدت با تخریب ماتریکس خارج سلولی ، به طور فزاینده ای به عنوان آنزیمهای مهم پردازش مولکولهای فعال زیستی شناخته می شوند. MS اکنون تکنیک اولیه پروتئومیک در تشخیص ، شناسایی و تعیین پروتئین در سلول ها یا بافت ها است. در اینجا ما از برچسب زدن به تمایل ایزوتوپ کد شده و کروماتوگرافی مایع چند بعدی درون خطی با MS پست سرهم استفاده کردیم تا پروتئین های سلولی سرطان پستان MDA-MB-231 را که از سطح سلول ریخته می شود یا ماتریکس دور سلول و پروتئین های خارج سلولی که پس از ترانسفکشن با غشای انسانی نوع 1 MMP (MT1-MMP)تخریب شده یا پردازش شده اند ، شناسایی کنیم. سوبستراهای بالقوه به عنوان مواردی که دارای سطح پروتئین تغییر یافته در مقایسه با E240A غیرفعال MT1-MMP جهش یافته یا انتقال دهنده وکتور شناخته شدند. سوبسترا های جدید با استفاده از matrix-assisted laser desorption ionization–time-of-flight MS و ترتیب توالی ادمن از قطعات شکاف پس از انکوباسیون با MT1-MMP نوترکیب در شرایط آزمایشگاهی از لحاظ بیوشیمیایی تأیید شدند. علاوه بر نقش های مرسوم که در بازسازی ماتریکس ، ما بسیاری از سوبستراهای MT1-MMP که قبلاً مشخص نشده اند را گزارش کرده ایم از جمله نوتروفیل کموکاین IL-8 ، مهار کننده پروتئاز لکوسیت ترشحی ، فاکتور نکروز توموری α، گیرنده مرگ 6 و فاکتور رشد بافت همبند ،که نشان دهنده اهمیت MT1-MMP است. علاوه بر این ، ماهیت بالا و توان بالا و برچسب زدن به میل وابسته به ایزوتوپ کد شده همراه با توالی یابی MS پشت سرهم یک نمایانگر تخریب برای کشف سوبسترا پروتئاز است که به طور کلی باید با سایر کلاس های پروتئاز برای بررسی عملکرد پروتئولیتیک در سیستم های بیولوژیکی پیچیده و پویا سازگار باشد.

By proteolytic modification of low abundant signaling proteins and membrane receptors, proteases exert potent posttranslational control over cell behavior at the postsecretion level. Hence, substrate discovery is indispensable for understanding the biological role of proteases in vivo. Indeed, matrix metalloproteinases (MMPs), long associated with extracellular matrix degradation, are increasingly recognized as important processing enzymes of bioactive molecules. MS is now the primary proteomic technique for detecting, identifying, and quantitating proteins in cells or tissues. Here we used isotopecoded affinity tag labeling and multidimensional liquid chromatography inline with tandem MS to identify MDA-MB-231 breast carcinoma cell proteins shed from the cell surface or the pericellular matrix and extracellular proteins that were degraded or processed after transfection with human membrane type 1-MMP (MT1-MMP). Potential substrates were identified as those having altered protein levels compared with the E240A inactive MT1-MMP mutant or vector transfectants. New substrates were biochemically confirmed by matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight MS and Edman sequencing of cleavage fragments after incubation with recombinant soluble MT1-MMP in vitro. We report many previously uncharacterized substrates of MT1-MMP, including the neutrophil chemokine IL-8, secretory leukocyte protease inhibitor, pro-tumor necrosis factor alpha, death receptor-6, and connective tissue growth factor, indicating that MT1-MMP is an important signaling protease in addition to its traditionally ascribed roles in pericellular matrix remodeling. Moreover, the high-throughput and quantitative nature of isotope-coded affinity tag labeling combined with tandem MS sequencing is a previously undescribed degradomic screen for protease substrate discovery that should be generally adaptable to other classes of protease for exploring proteolytic function in complex and dynamic biological contexts.